Preparación de los inóculos, conidios puros de Scedosporium prolificans
Las cepas estudiadas fueron sub-cultivadas
en tubos inclinados de agar papa dextrosa (APD) o agar dextrosa Sabouraud (ADS). Se sembró la cepa de hongo (S.
prolificans 99-059) en tubos de APD o ADS, y se incubaron a 28 ± 2 ºC durante 5 - 7 días.
Tras hacer crecer el
microorganismos en tres tubos inclinados de APD o ADS. Para obtener
la suspensión de conidios ser añadió al tubo 3 ml de solución salina esteril más Tween 20 (sse-tw20), que ayuda a la
resuspensión de los conidios, se agitó 2 veces con el vortex, durante unos 15
segundos. Luego se vertió la suspensión de conidios a un tubo estéril de 50 ml.
Esta operación se repitió tres veces en cada tubo.
Después de recoger los 27 ml, se deja reposar la suspensión de conidios
unos 10 minutos, ayuda a que se
precipiten las hifas al fondo del tubo. Pasado este tiempo, se filtra todo en mediante la técnica de la gasa y se recoge el
sobrenadante en otro tubo estéril de 50 ml y se toma una pequeña cantidad para
hacer un recuento al hemocitómetro. Posteriormente, a la suspensión de
conidios, se le hace tres lavados con sse-tw20.
Se centrifugó la suspensión de conidios por 5 minutos a 2000 rpm y se
lavó 2 veces con 30 ml de sse-tw20 y se resuspendio en 10 ml de sse-tw20. Se
realiza la evaluación de la concentración de conidios por ml mediante el
recuento en hemocitómetro en la cámara de recuento BURKER profundidad de
0,100mm y 0,0025mm2.
Para validar la viabilidad de
los conidios se sembraron placas petri de agar Sabouraud por triplicado de la
suspensión original cosechada y de la suspensión preparada en una concentración
de 1,67 x 106 conidios/ml. Las diluciones de la suspensión de
esporas: 1/103, 1/104, y 1/105, sembrando
100µl por placa petri respectivamente. Una vez inoculadas las placas petri, se
incubaron a 35 ± 2 ºC
durante 3 a 7 días, realizando un conteo del número de UFC a los 5 días. Se contaron las colonias de las placas petri
en la dilución que tenga entre 15
a 150 UFC por placa petri.
S. prolificans, inoculación mediante la técnica del espacido en placa Petri, en ADS, incubación a 35 ± 2 ºC, durante 5 días.Imagen Dalila Montañez, UPV-España.
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