PROYECTO DE TESIS DOCTORAL-Efecto protector del anticuerpo monoclonal C7 y sus CDRs frente a la infección por Scedosporium prolificans.

PROYECTO DE TESIS DOCTORAL

Don/ña.: Dalila del Carmen Montañez Graell con D.N.I. 1441101 alumno/a del Programa de Doctorado: Inmunología, Microbiología y Parasitología

DEPARTAMENTO/INSTITUTO: Inmunología, Microbiología y Parasitología

Areas de Conocimiento(1) 630 Materias de la UNESCO (2) 241406/241409

Descriptores o palabras claves Scedosporiosis Scedosporium prolificans Anticuerpo monoclonal Infecciones fúngicas invasoras experimentales

DESCRIPCION:

Efecto protector del anticuerpo monoclonal C7 y sus CDRs frente a la infección por Scedosporium prolificans.

ANTECEDENTES

En los últimos años se ha observado un aumento importante de infecciones fúngicas oportunistas que representan complicaciones serias (Dupont, 2002, Walsh et al., 2004). Entre los hongos responsables de las infecciones oportunistas, Scedosporium (S. prolificans y S. apiospermum) causa hasta el 10% de las infecciones invasoras por hongos filamentosos en pacientes predispuestos y ha emergido con un aumento importante de incidencia de casos en España, Australia, EE.UU. y el Reino Unido; a pesar de su carácter todavía excepcional, actualmente es la segunda causa de patologías por hongos filamentosos, después de Aspergillus. (Husain et al., 2003; Marr et al., 2002). Scedosporium produce infecciones severas localizadas que afectan a los huesos y a las articulaciones en individuos inmunocompetentes e infecciones sistémicas principalmente en inmunocomprometidos (Husain et al., 2005; Husain et al., 2003; Steinbach et al., 2003; Idigoras et al., 2001; González et al., 1998; Berenguer et al., 1997; Hughes et al., 1997; Spielberger et al., 1995; Marín et al., 1991; Alvarez et al., 1995). La baja sensibilidad de este hongo a muchos de los agentes antifúngicos disponibles, ha suscitado un especial interés en él.

La terapia de combinación está surgiendo como una alternativa para el tratamiento de las infecciones fúngicas (Kontoyiannis et al., 2002). La inmunoterapia pasiva, en forma de anticuerpos monoclonales antifúngicos, tiene el potencial de ser un socio ideal para la terapia de combinación. En la era pre-antibiótica, la administración pasiva de anticuerpos fue útil para el tratamiento de muchas enfermedades infecciosas. Esta clase de terapia fue abandonada debido al éxito de la antibioterapia. Por otra parte, la inmunidad mediada por células se ha considerada la principal arma inmunológica en la defensa antifúngica. Sin embargo, trabajos recientes demuestran la existencia de anticuerpos protectores contra algunos hongos patógenos (Han et al., 2000), aunque, en los sueros de animales inmunizados podrían estar neutralizados por anticuerpos no-protectores e incluso deletéreos (Bromuro et al., 2002). Actualmente, la tecnología moderna de anticuerpos monoclonales provee nuevas oportunidades para el desarrollo de terapias basadas en anticuerpos, utilizando exclusivamente los anticuerpos protectores. La ventaja de la inmunización pasiva reside en la posibilidad de proporcionar protección incluso a sujetos con respuesta inmune deficiente.

Nuestro grupo de investigación ha desarrollado el anticuerpo monoclonal C7 (AMc C7), una inmunoglobulina de ratón de clase M (IgM), que reconoce diferentes antígenos de micelio expresado predominantemente en la superficie de la pared de celular de C. albicans (Chaffin et al., 1998), así como antígenos presentes en C. krusei, C. tropicalis, C. glabrata, C. dubliniensis y C. lusitaniae, así como en algunos hongos filamentosos, como Cryptococcus neoformans, Scedosporium prolificans y Aspergillus fumigatus (Brena, 2005)

El AMc C7 posee cuatro actividades biológicas in vitro frente a C. albicans: i) inhibe la adhesión de C. albicans a células epiteliales Hep2 y a una variedad de superficies; ii) inhibe la germinación de C. albicans; iii) posee actividad candidacida directa (Elguezabal, 2003; Moragues et al, 2003; Omaetxebarria et al., 2005) y iv) posee actividad tumoricidad directa. (Polonelli et al., 2008). Este AMc C7 también ha demostrado en ensayos in vivo, poseer un efecto protector parcial contra la candidiasis invasora en ratones (Robledo, 2003; Sevilla et al., 2006).

Recientemente, se han realizado estudios con péptidos cuya secuencia reproduce fragmentos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) del C7, tanto de las cadenas ligeras (L1, L2, L3), como de las pesadas. (H1, H2, H3). El tratamiento con algunos de estos CDRs (H1, H2, L1) aumentó la superviviencia de animales infectados con C. albicans (Polonelli et al., 2008). Estos péptidos sintéticos, pueden por lo tanto ser una alternativa para la generación de nuevos agentes terapéuticos.

OBJETIVOS

El objetivo principal de este proyecto de tesis doctoral es evaluar la actividad antifúngica del AMc C7 y sus CDRs, solos o combinados con un antifúngico, en el tratamiento experimental de infecciones sistémicas por S. prolificans.

Nos planteamos los siguientes objetivos específicos:

• Evaluar la actividad in vitro del AMc C7 y sus CDRs (H1, H2, L1) sobre cepas de S. prolificans.
• Desarrollar un modelo de infección sistémica por S. prolificans en ratones Balb/c inmunosuprimidos.
• Evaluar la eficacia in vivo de la anfotericina-desoxicolato, la micafungina, anidulafungina en el modelo animal de infección sistémica por S. prolificans.
• Evaluar la eficacia in vivo del AMc C7 y sus CDRs en el modelo animal de infección sistémica por S. prolificans.
• Evaluar la eficacia combinada del AMc C7 y sus CDRs (H1, H2, L1) con el antifungico más apropiado, en el modelo animal de infección sistémica por S. prolificans.

METODOLOGIA:

1.- Microorganismos

Se utilizarán las cepas de S. prolificans NCPF 2799 y UPV 99-059. Las cepas serán sembradas y sub-cultivadas en tubos inclinados de agar papa dextrosa o agar glucosa de Sabouraud, y se incubarán a 28 ± 2 ºC durante 5 - 7 días para su posterior utilización, dependiendo de las experiencias que se vayan a realizar, ya sea para ensayos in vitro o in vivo.

2.- Línea celular

Se realizará el cultivo y conservación de la línea celular (hibridoma) productora del AMc C7D4 (Moragues et al, 2003), se cultivará a 37 ºC en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 en medio RPMI-PS-SBF 10%.

3.- Antifúngicos

Se evaluará la eficacia de los siguientes agentes antifúngicos frente a infecciones sistémicas inducidas por S. prolificans en modelos animales:

• Anfotericina B (AMB). Como Fungizona®, Obtenido de Squibb Industria. Farmacéutica, Madrid, España y Pharma Tek, Inc., Huntington, NY, EE.UU.
• Micafungina (FK463). Suministrado por Fujisawa Pharmaceutical Co. Ltd Osak -Japan
• Anidulafungina (ECALTA®). Suministrado por Pfizer, Madrid, España.

4.- Ensayos in vitro

Se realizarán ensayos para evaluar la actividad in vitro del AMc C7 y los CDRs (H1, H2, L1) sobre C. albicans y S. prolificans mediante el ensayo de reducción del MTT en medio Lee; y ensayos para evaluar la actividad in vitro candidacida del AMc C7 y los CDRs (H1, H2, L1) mediante el recuento de UFC en medio Lee.

También se realizarán pruebas para la determinación de la sensibilidad in vitro de cepas de Candida spp. por el métodos M27-A2 (NCCLS, 2002) y para las cepas de S. prolificans por el método M38-A (NCCLS, 2002).

5.- Ensayos in vivo

Se realizarán ensayos in vivo en base a un modelo experimental de infección sistémica por S. prolificans en ratones inmunosuprimidos y su posterior tratamiento. Durante el experimento se utilizarán ratones Balb/c hembras de 8 a 10 semanas de edad (10 animales por grupo), que pesarán entre 20 a 22g. Alojadas en jaulas de plástico, y alimentadas con dieta comercial y agua ad libitum.

La inmunosupresión de los animales se realizará mediante la administración intraperitoneal de ciclofosfamida (100mg/kg) a cada animal, los día pre-infección (el día -4 y -1, respectivamente). El día 0 se aplicará una inyección intravenosa vía vena de la cola de 0,2 ml de una suspensión de conidos, se ensayará con una DL90% y DL10% de cepas de S. prolificans.  El inoculo fúngico será ajustado, para obtener una infección invasiva con un tiempo medio de supervivencia entre 5 y 15 días, para apreciar variaciones en los parámetros indicados para la eficiencia in vitro de los diferentes tratamiento utilizados. Se ensayará con cuatro inóculos diferentes, de 10², 10³, 10⁴ y 10⁵ conidios, durante dichos ensayos..

Una vez establecida la dosis apropiada del hongo, se procederá a ensayar y determinar las dosis de tratamiento antifúngico que debemos inyectar a cada ratón (Clemons & Stevens, 2002).  Los tratamientos antifúngicos con anfotericina B-desoxicolato, micafúngina y anidulafúngina en dosis de 1mg/kg, 5mg/kg, 10 mg/kg y se realizarán tratamiento por 10 días post-infección. Los tratamientos de monoterapias antifúngicas in vivo que demuestren un mayor aumento en el tiempo medio de supervivencia y una mayor reducción de la carga fúngica en órganos, serán utilizados para proceder al tratamiento de terapia de combinación en conjunto con las dosis más efectivas del AMc C7 o sus CDRs (H1, H2, L1).

Cada ensayo estará constituido por 5 grupos, el grupo control del experimento, el grupo control de la infección que pueden ser dos grupos infectados que recibirán dos tratamientos diferentes de AMc C7, CDRs (H1, H2, L1) o antifúngico; y un grupo control del experimento que puede estar infectado o no, dependiendo si es control del diluyente del tratamiento antifúngico o control del ensayo del tratamiento con AMc C7 o sus CDRs (H1, H2, L1), en este caso pude ser una IgM irrelevante o un CDR irrelevante.

Cada tratamiento será repetido por duplicado, cada grupo estará integrado con 15 animales, 10 animales serán para determinar el tiempo de supervivencia, y otros 5 animales para determinar la carga fúngica en órganos por UFC después del tratamiento. Los animales serán sacrificados el día 5 y 11 del tratamiento para analizar los riñones, hígado, bazo y cerebro; y los mismos serán removidos asépticamente y una fracción será procesadas para determinar las unidades formadoras de colonias y finalmente una segunda fracción de cada órgano será procesada para observación al microscopio mediante técnica de tinción histológica y mediante microscopia de epifluorescencia con blanco de calcofluor.

REFERENCIAS

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OTROS ENLACES:

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