4.1.Estudios in vitro
4.1.1
Identificación de cepas de Scedosporium
/ Pseudallescheria
Se
realizaron estudios para verificar la identificación de las cepas estudiadas en
este trabajo, tomando en cuenta la morfología macroscópica y microscópica. También se realizaron pruebas de
crecimiento a diferentes temperaturas en medios sólidos de SDA y PDA, como en
medios líquidos de SDC y RPMI1640+MOPS; y para finalizar se realizó la
identificación moleculares por PCR.
4.1.1.1.Características macroscópicas
y microscópicas de Scedosporium spp.
Se
realizaron estudios para caracterizar la velocidad de crecimiento a diferentes
temperaturas de incubación en SDA y PDA. Las
cepas de Scedosporium spp. presentó
un crecimiento óptimo a 35 y 37ºC. Las cepas de Scedosporium spp. presentó un crecimiento variable a 40, 42 y 45ºC
(7 días) en los medios de cultivo sólidos como SDA y PDA. Algunas cepas
mostraron un crecimiento limitado a esas temperaturas y la disponibilidad de agua
disminuye debido a la deshidratación del medio aunque las placas contenían unos
25-30 ml de medio. Se obtuvieron valores medio del diámetro de crecimiento de
la colonia de Scedosporium spp. de
31,5 (21-36) mm a los 7 días y 63,85 (50-77) a los 14 días de incubación a 37ºC
en PDA (Ver tabla 4.1).
En
el medio SDC con agitación suave (120 rpm) durante 7días a 45ºC, se obtuvo
únicamente crecimiento de dos cepas de S.
prolificans (UPV 98-534 y UPV 98-535). Mientras que en RPMI tamponado con
MOPS, todas las cepas de S. prolificans pudieron
crecer a 45ºC. Las cepa de S. apiospermum
UPV 93-251 presentó crecimiento hasta una temperartura máxima de 42ºC para
ambos de cultivo líquidos estudiado. Ninguna de las cepas de Scedosporium prolificans fue capaz de crecer a 50ºC (7 a 14 días
de incubación). (Ver tabla 4.2.).
Tabla 4.1 Velocidad de crecimiento a distintas temperaturas de las cepas de Scedosporium / Psedudallescheria en
medios sólidos de SDA y PDA.
CEPAS
|
Velocidad
de crecimiento (mm)
|
|||||
SDA
|
PDA
|
|||||
37ºC
|
25ºC
|
37ºC
|
||||
Días
de incubación
|
||||||
7
|
14
|
7
|
14
|
7
|
14
|
|
Scedosporium prolificans
UPV 99-059
|
31
|
58
|
25
|
52
|
34
|
70
|
Scedosporium prolificans
UPV 99-058
|
21
|
40
|
20
|
39
|
21
|
53
|
Scedosporium prolificans
UPV 98-534
|
20
|
39
|
15
|
25*
|
22
|
50
|
Scedosporium prolificans
UPV 98-535
|
31
|
53
|
20
|
39
|
31
|
60
|
Scedosporium prolificans
UPV 96-025
|
24
|
48
|
18
|
35
|
23
|
57
|
Scedosporium prolificans
UPV 96-026
|
27
|
57
|
21
|
40
|
28
|
61
|
Scedosporium prolificans
NCPF 2799
|
28
|
56
|
20
|
38
|
36
|
64
|
Scedosporium prolificans
ATCC 201214
|
28
|
60
|
25
|
50
|
35
|
74
|
Scedosporium apiospermum
UPV 93-251
|
30
|
58
|
30
|
66
|
32
|
69
|
En
general, el aspecto macroscópico de las colonias de S. prolificans por el anverso fue de un color gris oliváceo pálidos
a negro, textura algodonosa, el reverso es marrón oscuro o negro; mientras que
las colonias de S. apiospermum presentó
un color blanco o crema y textura aterciopelada a algodonosa.
Por
lo general el color de las colonias de Scedosporium
spp. se incrementa por la esporulación y la edad del cultivo, el reverso de
sus colonias es amarillo pálido a marrón oscuro o negro (Figura 4.1).
Tabla 4.2. Crecimiento a diferentes temperaturas de las cepas de Scedosporium / Pseudallescheria, mediante estudió en medio líquidos de SDC y RPMI1640+MOPS.
CEPAS
|
Máximo crecimiento de temperatura (ºC)
|
|||||||||||
SDC
|
RPMI1640 + MOPS
|
|||||||||||
14 días de incubación a 120
rpm
|
14 días de incubación a 120
rpm
|
|||||||||||
25ºC
|
35ºC
|
40ºC
|
42ºC
|
45ºC
(7)
|
50ºC
|
25ºC
|
35ºC
|
40ºC
|
42ºC
|
45ºC
(7)
|
50ºC
|
|
Scedosporium prolificans
UPV 99-059
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Scedosporium prolificans
UPV 99-058
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Scedosporium prolificans
UPV 98-534
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Scedosporium prolificans
UPV 98-535
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Scedosporium prolificans
UPV 96-025
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Scedosporium prolificans
UPV 96-026
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Scedosporium prolificans
NCPF 2799
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Scedosporium prolificans
ATCC 201214
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Scedosporium apiospermum
UPV 93-251
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
+
|
+
|
+
|
+
|
-
|
-
|
Abreviaturas y símbolos que se utilizan: -, la cepa muestra una respuesta negativa; +, la cepa muestra una respuesta positiva; ±, la cepa muestra un escaso crecimiento casi negativo. Se valoró el crecimiento a diferentes temperaturas, mediante observación visual de la turbidez en el tubo y en el caso de las cepas o ± se verificó el resultado mediante observación microscopio (Nikon, modelo Labophot 2), con un objetivo 40x.
Figura
4.1. Aspecto
macroscópico de cepas de Scedosporium spp., 7 días de incubación a 37ºC
en PDA. (A) S.
prolificans UPV
99-059, colonias con crecimiento micelial aéreo corto y fino, por lo
general presenta colores que fluctúan desde gris verdoso pálidos a negro, con el tiempo desarrollan sectores
grises de apariencia algodonosa (B) revés
de la cepa S. prolificans UPV 99-059
(C) S. apiospermum UPV 93-251, colonias de crecimiento
micelial corto y denso, con una textura aterciopelada a algodonosa y de color blancuzco a crema. (D) revés de
la cepa S.
apiospermum UPV
93-251.
Las
observaciones (microscópicas) llevas a cabo mediante tinciones con azul de
lactofenol. Se apreciaron las características típicas de las cepas de Scedosporium / Pseudallescheria. S.
prolificans presentó hifas hialinas septadas, con conidióforos hialinos
largos o cortos con la base de las anélides ligeramente reducida y ensanchada, sus
conidios ovoides de color oliva a marrón con paredes gruesas, que pueden surgir
directamente de hifas o bien de fialides, distribuidos frecuentemente en
pequeños grupos de conidióforos ramificados en el vértice [de Hoog y col.,
2000; Kimura y col., 2010; Ruiz Diez, 1999]. Ver figura 4.2.
S. apiospermum presentó células conidiógenas (anélides) casi cilíndricas, que se
desarrollan directamente sobre hifas hialinas septadas indiferenciadas o a
partir de conidióforos escasamente ramificados, rectos y de longitud
variable con generación en su proporción distal de aneloconidios unicelulares
ovales y base truncada. Los conidios lisos, color pardo
amarillento, ovales o elipsoidales (5-12 x 4-6,5 μm) con la base truncada, se
acumulan en masas mucosas sobre las anélides o solitarios, o sésiles
desarrollándose de las hifas del micelio [de Hoog y col., 2000; Kimura y col.,
2010; Ruiz Diez, 1999]. Ver figura 4.2. y figura 4.3.
Figura 4.3. Aspecto microscópicas de especies de Scedosporium spp. estudiadas en este trabajo. Scedosporium apiospermum UPV 93-251, células conidiógenas con conidios terminales, hifas hialinas septadas. Tinción de blanco de calcofluor, aumento de x1000.
